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          細胞株如何轉染?你知道嗎?
          瀏覽次數:76發布日期:2020-11-09

          轉染 ,是將外源性基因導入細胞內的一種專門技能。隨著基因與蛋白功用研討的深化,轉染目前已成為試驗室工作中常常涉及的根本辦法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微打針和基因槍歸于通過物理辦法將基因導入細胞的范例;化學介導辦法許多,如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染辦法、和多種陽離子物質介導的技能;生物介導辦法,有較為原始的原生質體轉染,和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技能。

              抱負細胞轉染辦法,應該具有轉染功率高、細胞毒性小等優點。病毒介導的轉染技能,是目前轉染功率的辦法,同時具有細胞毒性很低的優勢。但是,病毒轉染辦法的準備程序雜亂,常常對細胞類型有很強的挑選性,在一般試驗室中很難遍及。其它物理和化學介導的轉染辦法,則各有其特色。

              需求指出的一點,無論采用哪種轉染技能,要取得zui優的轉染成果,或許都需求對轉染條件進行優化。影響轉染功率的因素許多,從細胞類型、細胞培育條件和細胞生長狀況,到轉染辦法的操作細節,都需求考慮。

          一、細胞株傳代

          1.試驗準備:200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),酒精棉球,廢液缸,試管架,微量移液器,記號筆,培育皿,離心管。

          2.棄掉培育皿中的培育基,用1ml的PBS溶液洗刷兩次。

          3.用Tip頭參加1ml Trypsin液,消化1分鐘(37℃,5%CO2 )。用手輕拍培育瓶壁,調查到細胞徹底從壁上脫落下來為止。

          4.參加1ml的含血清培育基停止反應。

          5.用Tip頭多次吹吸,使細胞徹底分散開。

          6.將培育液裝入離心管中,1000rpm離心5min。

          7.用培育液重懸細胞,細胞計數后挑選0.8X106個細胞參加一個35mm培育皿。

          8.將適宜體積徹底培育液參加離心管中,混勻細胞后悄悄參加培育皿中,使其均勻分布。

          9.將培育皿轉入CO2培育箱中培育,第二天轉染。

          二、細胞株轉染

          1.轉染試劑的準備

          ① 將400ul去核酸酶水參加管中,震動10秒鐘,溶解脂狀物。

          ② 震動后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震動。

          2.挑選適宜的混合比例(1:1-1:2/脂質體體積:DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中參加適宜體積的無血清培育基。參加適宜質量的MyoD或者EGFP的DNA,震動后在參加適宜體積的轉染試劑,再次震動。

          3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。

          4. 吸去培育板中的培育基,用PBS或者無血清培育基清洗一次。

          5. 參加混合液,將細胞放回培育箱中培育一個小時。

          6. 到時后,依據細胞品種決議是否移除混合液,之后參加徹底培育基持續培育24-48小時。

          三、第2次細胞傳代

          1. 在轉染后24小時,調查試驗成果并記錄綠色熒光蛋白表達狀況。

          2. 再次進行細胞傳代,依照免疫染色適宜的密度0.8X105個細胞/35mm培育皿將細胞從頭轉入培育皿中。

          3. 在正常條件下培育24小時后依照染色要求條件固定。 

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